search
ruРусский
banner
Дом / Блог / Комбинированный анализ протеома и метаболома дает представление о микроРНК.
Блог
pageSearch
Последние новости

Комбинированный анализ протеома и метаболома дает представление о микроРНК.

Aug 02, 2023Aug 02, 2023

Паразиты и переносчики, том 16, Артикульный номер: 271 (2023) Цитировать эту статью

732 Доступа

2 Альтметрика

Подробности о метриках

Патогенные вирусы могут передаваться самками комаров Aedes aegypti (Ae. aegypti) при поступлении с кровью позвоночных животных. Замалчивание специфичной для комаров и средней кишки микроРНК (миРНК) 1174 (миР-1174) ухудшает потребление крови и увеличивает смертность. Определение идентичности белков и метаболитов, которые реагируют на истощение миР-1174, расширит наше понимание молекулярных механизмов этой миРНК в контроле кровоснабжения и метаболизма питательных веществ у комаров.

Антисмысловые олигонуклеотиды (антагомиры [Ant]) Ant-1174 и Ant-Ct вводили самкам Ae. aegypti через 12–20 часов после закрытия, а истощение миР-1174 было подтверждено количественной ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией (RT-qPCR). Комаров, которым инъецировали Ant-1174, и контрольных комаров собирали перед приемом крови через 72 часа после инъекции для протеомного анализа на основе тандемной масс-метки и нецелевого метаболомного анализа с помощью жидкостной хроматографии и тандомной масс-спектрометрии для идентификации дифференциально экспрессируемых белков и метаболитов соответственно. РНК-интерференция (РНКи) с использованием инъекции двухцепочечной РНК (дцРНК) была применена для изучения биологической роли этих дифференциально экспрессируемых генов. Эффект РНКи был подтвержден с помощью RT-qPCR и вестерн-блоттинга. Содержание триглицеридов и уровни АТФ измеряли с использованием соответствующих наборов для анализа в соответствии с инструкциями производителей. Статистический анализ проводился с помощью программного обеспечения GraphPad7 с использованием t-критерия Стьюдента.

После истощения миР-1174, специфичной для комаров и средней кишки, в общей сложности было идентифицировано 383 дифференциально экспрессируемых белка (DEP), среди которых 258 имели повышенную экспрессию, а 125 - пониженную. Функциональный анализ этих DEP с использованием Gene Ontology (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) показал, что миР-1174 играет важную регуляторную роль в метаболизме аминокислот, метаболизме нуклеотидов, метаболизме жирных кислот и путях метаболизма сахара. Всего было идентифицировано 292 дифференциальных метаболита, из которых 141 имел повышенную активность и 151 пониженную. Интегративный анализ показал, что связанные дифференциальные белки и метаболиты в основном обогащаются различными метаболическими путями, включая гликолиз, цитратный цикл, окислительное фосфорилирование и метаболизм аминокислот. В частности, ген одного белка с повышенным уровнем экспрессии у комаров с истощением миР-1174, пуриннуклеозидфосфорилазы (PNP; AAEL002269), был связан с путями метаболизма пурина, пиримидина и ниацин-никотинамида. Нокдаун PNP серьезно подавлял переваривание крови и развитие яичников, а также повышал смертность взрослых. Механически истощение PNP приводило к значительному подавлению гена вителлогенина (Vg); кроме того, были затронуты некоторые важные гены в путях передачи сигналов экдизона и инсулиноподобных пептидов, связанных с развитием яичников.

Это исследование демонстрирует дифференциальное накопление белков и метаболитов в Ae, обедненных миР-1174. aegypti с использованием протеомных и метаболомных методов. Результаты предоставляют функциональные доказательства роли регулируемого гена PNP в физиологической активности кишечника. Наши результаты подчеркивают ключевые молекулярные изменения в Ae, обедненных миР-1174. aegypti и, таким образом, обеспечивают основу и новые идеи для лучшего понимания молекулярного механизма, вовлеченного в специфичную для линии микроРНК в комарах-переносчиках.

Самки комаров-переносчиков берут кровь у позвоночных, чтобы получить аминокислоты и другие питательные вещества, необходимые для развития яиц; следовательно, они служат переносчиками большого числа вирусных возбудителей. В условиях глобальной урбанизации и продолжающегося потепления климата риск заболеваний, переносимых комарами, растет во всем мире, создавая серьезную проблему для общественного здравоохранения и накладывая значительное экономическое бремя на многие страны [1]. За последние несколько лет получили признание ряд многообещающих стратегий и технологий борьбы с комарами-переносчиками, основанных на генетических манипуляциях [2,3,4,5]. Однако отсутствие эффективных медицинских мер по-прежнему ограничивает профилактику и борьбу с большинством заболеваний, передающихся комарами.

 1.2, as described in other studies [13,14,15,16] (Additional file 3: Table S3). The DEPs were subjected to GO enrichment [17] and KEGG pathway enrichment analyses [18]./p> 1 and P < 0.05 (unpaired two-sided Student’s t-tests) in the OPLS-DA model were considered to be differentially expressed metabolites (DEMs). Volcano plots and a hierarchically clustered heatmap were plotted to visualize significant features of the identified DEMs. Commercial databases, including KEGG (http://www.genome.jp/kegg/) and MetaboAnalyst 5.0 (http://www.metaboanalyst.ca/), were used for pathway enrichment analysis. Finally, integrated analysis of the proteome and metabolome was performed for the differential proteins and metabolites./p> 1.8 was considered to be satisfactory for subsequent experiments. The integrity of the extracted RNA was checked by 1% agarose gel electrophoresis. All primer pairs for the real time quantitative PCR (RT-qPCR) amplification of genes were designed using the software Primer Premier 5.0 and then synthesized at Sangon Biotech (Shanghai, China) (Additional file 7: Table S7). To examine the expression of the protein-coding genes, 1 µg of total RNA was reverse-transcribed into complementary DNA (cDNA) using the SuperScript™ IV First-Strand Synthesis System (TaKaRa Bio Inc., Otsu, Shiga, Japan). RT-qPCR was performed using TB Green Premix Ex Taq TM II (Tli RNaseH Plus; TaKaRa Bio Inc.). The reaction volume (20 µl) contained 10 µl of 2× NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus (Tiangen Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China), 0.8 µl of 10 µM primers, 0.4 µl ROX Dye II, 2 µl diluted cDNA and 6.8 µl ddH2O. Ribosomal protein S7 (RPS7; AAEL009496-RA) served as the internal control. Reactions were conducted on an ABI7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). The amplification procedure was: pretreatment at 95 °C for 1 min; followed by 40 cycles of 95 °C for 1 min and 60 °C for 1 min; ending with the generation of the dissolution curves at 95 °C for 15 s, 60 °C for 1 min and 95 °C for 15 s. To examine the expression level of miR-1174, 1 µg of total RNA was reverse-transcribed into cDNA using the SynScript® III miRNA RT SuperMix (TSK3001; Tsingke Biotechnology Co.,Ltd., Beijing, China). RT-qPCR was performed using a miRNA Universal SYBR qPCR Mix (TSE2001; Tsingke Biotechnology Co., Ltd.). The total reaction volume (20 µl) contained 10 µl of miRNA Universal SYBR qPCR Mix (Tsingke Biotechnology Co., Ltd.), 0.8 µl of 10 µM primers, 0.4 µl of 50× ROX Reference Dye II, 2 µl of diluted cDNA and 6.8 µl of ddH2O. Small nuclear RNA (snRNA) U6 (AAEL029000-RA) was used as the internal control. Reactions were conducted on the ABI7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) using the following amplification procedure: pretreatment at 95 °C for 1 min; followed by 40 cycles of 95 °C for 10 s and 60 °C for 30 s; ending with the generation of the dissolution curves at 95 °C for 15 s, 60 °C for 1 min and 95 °C for 15 s./p> 1.2, as used in other studies [13,14,15,16], we determined 383 DEPs, of which 258 were upregulated and 125 were downregulated (Fig. 1c; Additional file 8: Table S8). Hierarchical cluster analysis showed that these 383 DEPs were separated into upregulated and downregulated clades, and that the Ant-1174 group was differentiated from the control group (Fig. 1d); thus, miR-1174 depletion substantially caused a global protein expression response in mosquitoes./p> 1.2 or < 0.83, P < 0.05) illustrating the proteins differentially expressed between the Ant-1174 and control groups. The significantly upregulated differentially expressed proteins are shown in red, the significantly downregulated differentially expressed proteins are shown in blue and the proteins with no significant difference are shown in gray. d Hierarchical clustering analysis of the differentially expressed proteins visualized as a heatmap. The color blocks in different positions represent the relative expression of the corresponding proteins: red represents high expression and blue represents low expression. e Bubble chart showing GO enrichment of Ant-1174 vs Control. f KEGG pathways enriched by differentially expressed proteins between Ant-1174 and control group. Ant-1174/Ant-Ct, antisense oligonucleotides (antagomirs) Ant-1174/Ant-Ct; BP, biological Process; CC, cellular component; GO, Gene Ontology; KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; MF, molecular function; miRNA-1174, microRNA-1174; PIJ, postinjection; WT, wild type/p> 1 and P value (in a Student’s t-test) < 0.05 yielded 292 differential metabolites, of which 141 were upregulated and 151 were downregulated (Fig. 2d; Additional file 9: Table S9). Hierarchical clustering analysis of these differential metabolites showed that samples of the same group were clustered in one clade and those of different groups were separated from each other (Fig. 2e; Additional file 10: Table S10). The upregulated metabolites could be divided into 10 super classes, of which the top five were organic acids and their derivatives; lipids and lipid-like molecules; organoheterocyclic compounds; organic oxygen compounds; and benzenoids (Fig. 2f; Additional file 11: Table S11). The downregulated metabolites could be divided into 11 super classes, of which the top five were organic oxygen compounds; organic acids and derivatives; lipids and lipid-like molecules; organoheterocyclic compounds; and nucleosides, nucleotides and analogs (Fig. 2f; Additional file 11: Table S11). In the super class organic acids and derivatives, 41 metabolites (76%) of POS mode and 24 metabolites (69%) of NEG mode belonged to the subclass amino acids, peptides and analogs. In the super class organic oxygen compounds, eight metabolites (62%) of POS mode and 29 metabolites (81%) of NEG mode belonged to the subclass carbohydrates and carbohydrate conjugates. We then performed a KEGG pathway enrichment analysis of these DEMs (Fig. 2g; Additional file 12: Table S12), which revealed that the DEMs were mainly enriched in the pathway aminoacyl-tRNA biosynthesis, followed by purine metabolism, glycerophospholipid metabolism, galactose metabolism, pyrimidine metabolism, glycine, serine and threonine metabolism, arginine and proline metabolism, pentose and glucuronate interconversions, alanine, aspartate and glutamate metabolism, cysteine and methionine metabolism, lysine degradation, amino sugar and nucleotide sugar metabolism, sphingolipid metabolism and glyoxylate and dicarboxylate metabolism./p>

Предыдущий: Введение в испытание на боковой поток: сильные стороны, ограничения и применение Следующий: Предварительная обработка кривых поглощения терагерцового диапазона с помощью узкого ограничения волнистости и ее быстрая реализация, предложенная выпуклой оболочкой.
Отправить запрос
Отправлять